基因干擾(RNAi)是一種在動物、植物和微生物中高度保守的基因表達調控工具。1998年,Fire等首次在秀麗隱桿線蟲中證明了觸發基因沉默的關鍵因子是雙鏈RNA(dsRNA),而非單鏈RNA。具體而言,dsRNA被Dicer-like蛋白隨機剪切成長度為21～24nt的小RNA(siRNA或 miRNA),siRNA與Argonaute蛋白(AGOs)結合形成RNA誘導的沉默復合體(RISCs),該復合體與目標RNA鏈互補,誘導mRNA降解或抑制翻譯進程。利用RNAi技術靶向有害生物的必須基因,實現高效的基因沉默,可有效控制病蟲害的發生。基于RNAi技術創制的新型核酸農藥被稱為農藥史上第三次革命,與傳統化學農藥相比,具有靶向性高、易降解、靶點豐富及可靈活設計等優勢。

目前,RNAi在植物病蟲害防控領域的應用主要通過4種途徑實現：

(1)HIGS,即培育表達dsRNA的轉基因植物以防治病蟲害；

(2)VIGS,即利用病毒或微生物表達和遞送靶標生物dsRNA的方法；

(3)SIGS,即創制噴灑型RNA農藥,直接噴施于植物表面以控制病原菌和害蟲；

(4)NDGS,即利用納米載體遞送dsRNA以誘導靶標基因沉默的方法。

本文介紹了以RNAi為核心的病蟲害防治技術的研究現狀,分別論述了基于HIGS、VIGS、SIGS和NDGS 策略的RNAi技術用于防治植物病蟲害的應用實例及商業化情況,并對核轉基因技術培育轉基因作物和創制噴灑型RNA農藥的瓶頸問題進行總結,點明了葉綠體介導的RNAi技術和納米載體遞送dsRNA策略的優勢。dsRNA的合成成本、保護劑和載體制備工藝、轉基因植物和載體的生物安全性評估,仍然是未來在研發和商業化生產中需要關注的問題。

2 利用HIGS策略防控病蟲害

2.1 核轉基因技術的應用

研究人員已成功實現利用轉基因植物表達調控病蟲害生長發育關鍵基因dsRNA,降低靶基因的表達量,導致靶標生物死亡或發育畸形,從而控制病蟲害發展的策略。通過核轉基因工程向細胞核導入外源基因的核基因轉化技術是一種主要的HIGS策略。

2.2 基于核轉基因技術培育轉基因作物的瓶頸

雖然核轉基因技術在防治病蟲害領域取得了顯著成果,但是傳統核轉基因技術表達的dsRNA會進入植物細胞質,被植物自身的Dicer酶識別和剪切,導致ds RNA無法在細胞內穩定積累,難以被加工成有效的siRNA,影響了對靶標生物的RNAi效率和防控效果,導致轉基因作物的抗蟲效果不明顯。以葉綠體基因組作為遺傳操作平臺的葉綠體(質體)基因工程技術克服了核轉基因技術中的缺陷,拓寬了植物基因工程在防治病蟲害領域的應用。 

2.3 葉綠體轉基因技術的應用

植物細胞中質體基因組的拷貝數可達1萬,且缺乏RNAi機制,使得質體轉基因技術成為表達 dsRNA的理想工具。近年來,相比于核轉基因技術,葉綠體基因工程的優勢逐漸顯現,如減少了核轉基因技術對植物生長發育的影響；在葉綠體中能穩定積累ds RNA以避免進入植物自身的RNAi系統等,這使得葉綠體轉基因技術成為植物基因工程的一個新研究熱點。目前,葉綠體介導的RNAi技術在防治植物病害方面的研究較少,但有一些基于葉綠體轉基因技術表達抗菌蛋白,用于提高植物抗病性的研究。 

3 利用VIGS策略防控病蟲害

在農業領域,利用VIGS策略不僅能夠改善農藝性狀,還能防治病蟲害,為作物提供保護。病毒是VIGS策略中的主要載體,由于病毒獨特的侵染機制,能有效幫助dsRNA逃脫生物體的物理和生理屏障,在寄主體內實現dsRNA的高效遞送。此外,利用微生物表達和遞送dsRNA的方法也被歸屬于VIGS策略。例如,采用能產生dsRNA的大腸桿菌喂養昆蟲,不僅可以避免dsRNA被昆蟲消化系統中的酶降解,還能實現dsRNA的可持續供應。此外,利用共生菌產生害蟲特異性的dsRNA,是一種無創傷遞送dsRNA的方法,適用于多種靶標害蟲。當靶標害蟲攝入共生細菌后,細菌能在害蟲體內持續增殖,保障充足的dsRNA,實現可持續的基因沉默。 

4 利用SIGS策略防控病蟲害

研究人員對噴灑型RNA農藥防治農業病蟲害進行了廣泛的試驗,證明SIGS是一種具有潛力的非轉基因RNAi策略。SIGS策略比HIGS策略在病蟲害防治中具有更廣闊的應用前景。例如,噴灑型的RNA農藥研發成本低,周期較短,應用場景多且無需面臨嚴格的市場監管和登記審查。當dsRNA能夠廉價、大規模地生產時,噴灑型RNA農藥將是防治病蟲害的理想藥劑。

5 利用NDGS策略防控病蟲害 

5.1 創制噴灑型RNA農藥的瓶頸

噴灑型RNA農藥在植物表面能直接被昆蟲或病原微生物吸收,誘導有害生物靶標基因的沉默。在實際生產應用中,噴灑型RNA農藥受諸多環境因素限制。有研究報道,直接噴施的dsRNA暴露于空氣中會被核酸酶和紫外線降解,而在自然環境中,雨水沖刷和氣流變化會直接影響植物葉面dsRNA 的積累量,導致無法觸發有效的RNAi反應。昆蟲或病原微生物內部的核酸酶和pH環境都會影響dsRNA的穩定性,嚴重影響了RNA農藥在有害生物體內的干擾效率。此外,昆蟲的體壁和微生物的胞壁是阻礙dsRNA攝入的主要物理屏障,降低了噴灑型RNA農藥的遞送效率。例如,疫霉吸收dsRNA 的能力非常有限,炭疽菌則不能直接吸收dsRNA,而有益真菌綠色木霉吸收dsRNA的能力較弱。因此,研發納米載體保護和遞送dsRNA來克服噴灑型RNA農藥應用瓶頸已成為前沿熱點。

5.2 納米載體對dsRNA的保護

由于dsRNA被植物吸收不是一個瞬時的過程,有延遲效應,噴灑型RNA農藥在田間的應用效率與 dsRNA在環境中的穩定性密切相關。高效的RNAi依賴于充足的dsRNA,但實際應用中諸多因素會影響 dsRNA在植物表面的積累。基于納米載體的遞送策略能高效保護dsRNA,提升dsRNA在工作環境下的穩定性。納米載體不僅能增加dsRNA在葉面的滯留量,減少因噴霧飄移而造成的損失,還能保護dsRNA 免受核酸酶降解和生物體內pH微環境的影響,提高dsRNA在生物體內的穩定性。有研究報道以生物黏土作為dsRNA的遞送載體,發現其能夠減少dsRNA因沖淋而產生的流失,提升了RNAi效率,延長了植物對病毒病的抗性周期。在另一項報道中,陽離子聚合物作為dsRNA的遞送載體,在昆蟲高堿性的腸道環境中為dsRNA提供了保護,提升了甜菜夜蛾的RNAi效率。 

5.3 納米載體對dsRNA的遞送

基于納米載體的遞送策略還能有效促進dsRNA 在細胞內的擴散、攝取和內體逃逸,通過上調一些與攝取機制相關的基因,激活網格蛋白介導的內吞作用,提升dsRNA的遞送效率。在細胞攝取納米RNA復合物后,有些帶胺基的納米載體在細胞內酸性環境中會出現質子化效應,誘發溶酶體逃逸,釋放dsRNA或siRNA進入細胞質,大幅度提升RNAi的遞送效率。這種納米載體還能穿透植物表皮屏障,將外源dsRNA送入植物體內,提升了dsRNA進入植物細胞的能力。

6 RNA農藥應用實例

6.1 轉基因植物介導RNAi的應用實例

基于轉基因植物介導的RNAi技術在防治病蟲害領域表現出巨大的應用潛力。在一些包含田間試驗的科研型案例中,基于轉基因植物介導的RNAi技術用于防治病蟲害展現出良好的商業化前景。例如,在田間試驗中,轉基因棉花的葉片受損面積比正常植株減少了46%～53%,轉基因棉花的單鈴重量較正常植株增大了48%,有效減少了綠盲蝽對棉花產量和質量的損害。此外,在防治植物病害的應用方面, 由于轉基因棉花表達真菌vdH1基因的dsRNA能夠成功運輸到真菌細胞中,并誘導病菌的基因沉默,阻礙了病原菌微菌核的形成,有效提高了轉基因植株對大麗輪枝菌的抗性。拜耳、先正達等國際農藥公司投入大量的人力和財力,并掀起了研發和商品化轉基因植物的熱潮。目前,拜耳公司在轉基因玉米方面的研發已取得了顯著成果,并基本投入商業化生產。

6.2 非轉基因形式RNA農藥的應用實例

目前,非轉基因形式RNA農藥在田間的有效性得到了越來越多的驗證,但非轉基因形式的RNA農藥在田間應用案例較少,主要的障礙可能是生產dsRNA的成本高昂。ds RNA制劑易應用于甲蟲類害蟲。例如,在噴藥初期,dsRNA藥劑對害蟲的防治效果為32%,不如化學藥劑的防治效果,但在施藥7d后,dsRNA制劑的防治效果與市售殺蟲劑類似,達到了84%～95%。在田間噴灑RNA農藥防治其他害蟲,如鱗翅目和半翅目害蟲的效果似乎不如甲蟲類,部分原因在于甲蟲類具有較少的降解酶且dsRNA不易被溶酶體消化,因而適合用于RNAi 。2019年,拜耳公司申請了噴灑型dsRNA用于防治蜜蜂狄斯瓦螨的產品登記。2022年,美國Greenlight Biosciences公司宣布申請登記了一種用于防治馬鈴薯甲蟲的噴灑型dsRNA制劑。在防治植物病害方面,該公司宣布正在積極研發基于RNAi策略防治白粉病和灰霉病的噴霧型產品,預計于2025年獲得批準上市。硅羿科技有限公司研發的煙草花葉病毒核酸干擾素目前已經完成登記測試,這種干擾素能夠有效減少病毒病對煙草或其他茄科植物造成的經濟損失。 

7 展望 

7.1 靶基因的篩選

靶基因篩選是影響RNAi效率的關鍵因素之一。理想的靶基因應該具備高致死和低劑量敏感等特點。若單個靶基因效果不好,可以2個或多個靶基因同時干擾,從而提升有害生物的死亡率。靶基因的篩選和挖掘是一項費時費力的工作,需要更多的研發投入。

7.2 低成本dsRNA的研發與工藝優化

基于RNAi技術防治病蟲害的商業化案例有限,很大程度上受限于dsRNA的研發成本和復雜的工藝。目前,無論是在體內或體外合成dsRNA,主要是依賴噬菌體的T7序列和RNA聚合酶轉錄獲得特異性序列。在植物基因工程中,培育表達靶標生物dsRNA的轉基因植物耗時長、步驟復雜、效率低且成本高昂。在噴灑型RNA農藥的研發中,如果采用商業化試劑盒合成所需的dsRNA,步驟雖然相對簡單,但試劑成本高昂,生產規模小,且容易發生非特異性擴增導致dsRNA質量不佳。大腸桿菌或酵母表達體系是dsRNA低成本大批量合成的最常用工具。美國Greenlight Biosciences公司建立了以釀酒酵母發酵生產dsRNA的平臺,通過在酵母中表達dsRNA用于害蟲治理。該公司還開發了成本為0.5美元/g的dsRNA 產品用于抗病或殺蟲,適合實際生產應用。此外,利用微生物產生特異性的dsRNA以誘導靶標生物的RNAi,在防治病蟲害方面具有良好的應用前景。由于真菌、病毒或細菌的修飾相對容易,且能持續產生dsRNA,因而在基因遞送和蛋白質表達方面都有應用。由于納米材料載體對RNA制劑的高效保護和遞送作用,低成本環保型納米載體的需求無疑會越來越大。目前,我國科研界使用較多的星形陽離子聚合物納米載體(SPc)的生產成本約為1.3美元/g,當大規模工業化生產后,能夠進一步降低生產成本。

7.3 基于遞送策略的安全性

目前,基于納米載體、菌液或病毒的遞送策略已被證實能有效提高ds RNA的遞送效率并為其提供保護。其中,納米材料作為遞送載體的生物安全性一直備受關注,即納米材料的降解問題、在環境中的擴散風險以及對非靶標生物的毒性。正常田間使用濃度無不良副作用,只有在極高濃度下,雖然不會影響異色瓢蟲卵的孵化率,但會降低多種膜蛋白和溶酶體基因的表達量,損傷昆蟲的腸道組織,導致幼蟲死亡。另外,研究發現,只有極高濃度(1g/L)的SPc才會對果蠅的壽命、生育能力、攀爬能力以及抗逆性產生不利的影響,長期飼喂SPc則會積累在果蠅腸道組織中,并引起全身性變化。這些工作為評估納米材料的生物安全性提供了方法和參考。另外,基于微生物系統的遞送平臺在環境中傳播也可能會對人產生潛在的威脅。 

7.4 基于4種策略的應用前景 

7.4.1 HIGS策略

生物技術的快速發展使得培育抗蟲或抗病轉基因作物的方法越來越豐富,尤其是質體轉基因技術在防治病蟲害領域的應用。有研究報道,質體轉基因技術通過表達多基因組元件,可同時賦予轉基因植物對蟲害、病害和非生物脅迫條件的抗性。雖然在一些單子葉植物中,由于缺乏葉片的再生體系,質體轉基因技術無法利用多次再生培養和篩選來獲得轉化植株,但該技術符合植物基因工程未來的發展方向,即安全、穩定和高效地表達有害生物的靶標基因ds RNA,因而將廣泛地應用于農業領域。 

7.4.2 VIGS策略

在農業病蟲害治理方面,以病毒或微生物作為 dsRNA的載體用于觸發靶標生物RNAi的策略具有應用潛力。未來,將病毒或微生物作為dsRNA的高效遞送載體,還需要開發導入產生特異性dsRNA所需模板的有效方法,為大規模創制施用藥劑奠定基礎。另外,病毒或微生物在田間大規模施用之前,亟需解決的是在環境中釋放病毒或微生物所引起的潛在問題。 

7.4.3 SIGS策略

近年來,噴灑型RNA農藥在病蟲害防治領域取得了長足的進展,具有廣闊的應用前景。例如,研發噴灑型RNA農藥所需的時間比培育轉基因植物短,噴灑型RNA農藥能夠相對快速地應對新環境和新入侵的病蟲害,從而實現病蟲害的應急管理。雖然,噴灑型RNA農藥在田間大規模應用之前還需要克服諸多瓶頸限制,但目前已有基于載體或其他保護劑的遞送系統用于提升dsRNA的穩定性和遞送效率,從而實現噴灑型RNA農藥對病蟲害的高效治理。 

7.4.4 NDGS策略

利用納米載體來保護和遞送RNA農藥快速進入植物和害蟲體內無疑具備廣闊的發展前景。此外,可通過研發多元化的RNA制劑解決RNA農藥田間防效不理想的困境。納米載體通過內部的疏水結構結合苦參堿,同時借助外部基團的電荷作用及氫鍵作用進一步結合dsRNA,通過RNAi引起桃蚜細菌性感染,防效可提升至90%,與化學農藥的防效相當。這種利用納米載體同時裝載dsRNA和藥劑的新思路可以治理害蟲的抗藥性、大幅度提升害蟲的防治效果。干擾蚜蟲對噻蟲嗪應急響應基因synapsin之后,半數致死劑量條件下的噻蟲嗪對蚜蟲的致死率上升至100%,低劑量噻蟲嗪對蚜蟲的致死率也能達到90%。未來,還應該進一步設計智能響應型納米載體(機器人),實現多功能、精準靶向和可控遞送,不斷提升RNA農藥的田間效果,使其接近或達到化學農藥的防治效果。

作者：關梅,晁子健,閆碩,沈杰

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