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來源：《中國農業科學》2022年第15期

作者：關若冰1,2,李海超1,2,苗雪霞2*(1.河南農業大學植物保護學院；2.中國科學院分子植物科學卓越創新中心昆蟲發育與進化生物學重點實驗室)

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01  

RNA干擾技術應用研究進展

RNA干擾(RNA interference,RNAi)機制自1998年發現以來,已經被廣泛應用于基因功能、生物醫藥以及農作物病蟲害防控等領域。RNAi技術通過特異性抑制靶標基因的表達,導致與目標基因相關的生理功能缺失,或形成功能缺陷,從而對靶標基因功能進行分析研究,尤其是在基因敲除、基因編輯平臺不太成熟的非模式物種中,該技術極具優勢。

在生物醫藥領域,自RNAi技術被發現以來,就被眾多醫藥巨頭給予極大的關注,并在此領域進行了規模龐大的布局,同時涌現很多基于RNAi技術成立的醫藥科技公司,使得這一技術在生物醫藥領域呈現暴發性的發展。2018年,Alnylam公司開發的全球首款RNAi藥物patisiran獲得美國食品藥品監督管理局(U.S. Food and Drug Administration,FDA)上市許可,這是全球第一款RNAi藥物,主要用于治療成人遺傳性轉甲狀腺素介導淀粉樣變性引起的多發性神經病變,該疾病每年治療費用高達34.5萬美元。隨后,在2019年和2020年,同樣由Alnylam公司開發的第二款、第三款RNAi新藥分別上市,這3款藥物均為針對罕見病治療的孤兒藥。2020年12月,歐盟批準了諾華公司研發的用于治療原發性高膽固醇血癥的RNAi藥物inclisiran,實現了RNAi藥物從罕見病到常見慢性疾病的飛躍,該藥于2021年12月獲得美國FDA的上市許可。這些新藥的出現,改變了現有醫藥研發的格局,同時再次觸發了各大醫藥公司對該領域的投資熱情,僅2021年,全球RNAi療法領域發生64起投融資事件(含IPO,initial public offering,首次公開募股),總金額超50億美元。此外,還有46項RNAi藥物的合作交易發生(見2021年全球RNA療法領域投融資年報)。

在農業領域,RNAi技術同樣被寄予厚望,尤其是在病蟲害防控領域,被稱為″農藥史上的第三次革命″。利用RNAi技術沉默有害生物生長發育過程中重要基因的表達,導致其生長發育障礙或者死亡,從而降低有害生物對農作物的侵害,實現病蟲害防治,達到農作物安全生產的目的。利用RNAi技術進行病蟲害防治具有防治目標專一性、靶標開發的便捷性、應用方便易于操作、綠色無污染、無殘留及環境兼容性強等眾多優勢,完全符合公眾對于綠色農藥的需求。在RNA生物農藥研發領域,目前已經有產品上市或準備上市。拜耳公司的第一款表達昆蟲雙鏈RNA(double-strand RNA,dsRNA)的抗蟲轉基因玉米于2017年獲得美國環境保護署(U.S. Environmental Protection Agency,EPA)的種植許可,2021年獲得中國農業農村部轉基因安全許可證書,預計2022年推廣上市；同時,多款基于噴灑的RNA生物農藥已經提交或者準備提交EPA審核。

我國在利用RNAi技術進行病蟲害防治領域的基礎研究中,起步較早、起點較高,但是在應用領域,由于缺乏規模化、系統化的研究投入,目前,與國際農化巨頭的研究還存在一定的差距。在此背景下,迫切需要我們在該領域加快研究步伐,同時建立與RNA生物農藥相匹配的研發、應用、生產等技術標準,完善相應的法律法規,對生產進行指導與監管,以此來促進RNA生物農藥的商業化進程。基于此,本文就目前國際RNA生物農藥公司的研究及開發現狀,以及一些國家對于RNA生物農藥相關政策進行綜述,為RNA生物農藥發展形勢及政策解讀提供參考。

02

RNA生物農藥商業化進程

2.1  國際上主要從事RNA生物農藥研發的公司及其發展現狀

自RNAi現象被發現以來,20余年的實踐證明,各大農藥公司對于RNA生物農藥的研制經歷了快速入場、瓶頸期撤離、技術突破后再次入場及高速發展等幾個時期。1998年,RNAi技術一經發現,國際上幾大農藥公司,如拜耳、孟山都、先正達、巴斯夫等均投入大量的人力和財力開始了RNA生物農藥的開發以及應用研究,掀起了RNA生物農藥研發的第一波熱潮。但是,由于dsRNA生產、遞送及保護技術尚未解決,從2010年到2018年,大量資本紛紛離場,RNA生物農藥的研發經歷了相當長時間的低谷期。近年來,隨著RNAi藥物研發的蓬勃發展以及相關技術的突破,針對RNA生物農藥的研發也進入了快速發展時期。目前,拜耳(孟山都)在轉基因玉米(MON87411)以及噴灑型RNA生物農藥(BioDirect)應用研發方面,均取得了非常顯著的成果,基本實現了商品化。先正達在利用RNAi技術進行病蟲害防控方面也取得了極具商業價值的成果。同時,一些新興農化公司及大量資本也加入到RNA生物農藥開發的行列,極大地促進了RNA生物農藥的研發及商業化進程。

2.1.1  dsRNA生產相關公司概況

成立于2008年的Greenlight Biosciences,主要致力于人類健康和農用RNA產品的生產和研發。該公司建立了多種平臺的dsRNA生產工藝,其專有的無細胞生產系統,能夠將dsRNA的生產成本控制在1美元/g的價格,并且能夠保證生產dsRNA的技術級活性成分(technical grade active ingredient)。該公司目前有多款抗病、抗蟲的RNA生物農藥產品在積極研發,并準備或已經提交EPA審批。公司因擁有較為成熟的RNA生產平臺,近年來得到資本市場的廣泛關注,從2013年至2020年,獲得數億美元融資,其中2020年6月16日,D輪超額認購融資1.02億美元,成為2020年度全球農業技術領域融資排名第二的投融資事件；2021年5月20日,拜耳將其防治蜜蜂狄斯瓦螨(Varroa destructor)的RNAi相關專利與Greenlight Biosciences共享,授權該公司進行dsRNA合成；2021年9月21日,該公司宣布其在紐約羅徹斯特的制造工廠開業,投入使用后,預計dsRNA的年產量可達100噸級規模；2021年8月10日,Greenlight Biosciences在無任何產品商業化的背景下,與SPAC Environmental Impact Acquisition Crop完成12億美元并購,在納斯達克上市。Greenlight Biosciences表示,該交易從SPAC獲得2.82億美元以及1.05億美元的PIPE(上市后私募投資,private investment in public equity)融資。這些收入將用于開發基于RNA的殺蟲劑、流感候選疫苗以及其他未被滿足的醫療需求,該公司預計在2022年推出首款產品(https://greenlightbiosciences.com/)。

美國另外一家專門從事dsRNA高效、經濟、大規模生產的公司RNAgri,宣稱其dsRNA合成平臺能夠將dsRNA的生產成本控制在1美元/g,該公司于2020年6月18日被RNAissance Ag LLC收購。RNAissance Ag LLC是2019年1月24日由投資公司TechAccel LLC(https://techaccel.net/)和Donald Danforth Plant Science Center共同成立的子公司,專門開發針對小菜蛾(Plutella xylostella)的噴霧式RNA生物農藥。2021年,由TechAccel LLC在圣路易斯建立新的辦公室(TechAccel LLC和RNAissance Ag共同使用),用于RNA生物農藥相關的小規模實驗研發、生產、發酵(https://www.rnaissanceag.net/)。

韓國的Genolution公司開發出一種有效程序,通過發酵平臺合成毫克(mg)至千克(kg)規模的dsRNA(200～800 bp)(http://genolution.co.kr/)。此外,總部位于加拿大溫哥華的Renaissance BioScience公司建立了以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)發酵生產dsRNA的技術平臺,通過在酵母中表達針對不同物種靶標基因的dsRNA,用于害蟲防控。2021年9月,該公司宣布,基于噴灑的針對馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)的RNA生物農藥產品,在一項獨立測試中對幼蟲的致死率達到98.3%,大大降低了馬鈴薯甲蟲對作物造成的損害(https://renaissancebioscience.com/)。

上述公司的主要優勢均集中在dsRNA的生產上。通過這些公司的不斷開發,dsRNA的生產成本從2008年的12,000美元/g降到了2021年的1美元/g。通常情況下,dsRNA的使用量非常低,每英畝(約0.4公頃)僅需1～5 g。由此看來,目前的dsRNA生產成本已經完全能夠滿足商業應用。解決了dsRNA的大量生產和價格問題,預示著RNA生物農藥商業化應用的根本問題得到了有效解決。

2.1.2  dsRNA遞送研發相關公司概況

dsRNA在環境中的穩定性對于RNA生物農藥的應用至關重要。目前已有多家公司專注于解決該問題,并開發出了獨特的RNA包被及制劑平臺。例如,初創公司AgroSpheres開發了一種專有的生物顆粒平臺,該平臺由缺乏染色體的小型球形細胞組成,可以封裝dsRNA,從而減緩dsRNA的降解,同時增強其在病蟲害中的傳遞(https://agrospheres.com/)。近年來,AgroSpheres已經獲得多項融資,并與幾家大型全球公司建立合作伙伴關系；NanoSUR公司開發了一個專有平臺來改良生產的dsRNA,通過一定的包被,使其成為MdsRNA,能夠提高跨膜效率,防止其被快速降解,進而提高RNA生物農藥的效率(http://www.nanosur.com/)；Trillium Ag開發了新型農業生物平臺Agrisomes,能夠通過對dsRNA進行修飾和組裝,提高dsRNA的靶向性、特異性、遞送效率及穩定性,進而克服農業生產中RNAi應用的很多關鍵障礙(http://www.trilliumag.com/)。這些公司研發的核酸包被平臺,大大提高了dsRNA在環境中的穩定性,從而加快了RNA生物農藥的商業化進程。

2.1.3  我國RNA生物農藥應用研究現狀

我國在RNA生物農藥研發領域的起點比較高,最早在2007年,中國科學院上海生命科學研究院陳曉亞院士團隊與孟山都公司同步作出了具有里程碑意義的研究成果,隨后大量的研究團隊在這一領域進行了各個層面的深入研究。如中國科學院分子植物科學卓越創新中心苗雪霞團隊在多物種靶標基因庫構建、制劑配方優化、規模化生產體系以及安全性評估等領域進行了大量的研究；中國科學院微生物研究所郭惠珊團隊利用跨界RNAi技術,構建了棉花抗黃萎病體系；中國農業科學院植物保護研究所王桂榮團隊針對棉花害蟲綠盲蝽(Apolygus lucorum)構建了植物介導的RNAi轉基因玉米與大豆系統；中國農業大學沈杰團隊通過納米包被技術顯著提高了dsRNA的穩定性,進而提高昆蟲RNAi效率；中山大學張文慶團隊以及山西大學張建珍團隊針對褐飛虱(Nilaparvata lugens)和飛蝗(Locusta migratoria)的靶標基因篩選均取得了較好的研究進展。但是,我國在成果轉化、產業化及商業化程度上顯著落后于國際水平。同時,由于國內大型農藥企業的缺失,目前尚無成熟的RNA生物農藥產品。截至2022年2月,我國基于RNAi技術的生物農藥企業,僅有上海植生優谷生物技術有限公司在棉蚜(Aphis gossypii)、桃蚜(Myzus persicae)、黃曲條跳甲(Phyllotreta striolata)等害蟲的田間測試均取得了較好的防治效果,同時,在dsRNA規模化生產方面取得了實質性的進展,計劃于2023年提交農藥登記申請；此外,以上海交通大學農業與生物學院首席研究員唐雪明為創始人的硅羿科技(上海)有限公司,于2021年通過全國農藥標準化委員會審核,獲得了3張RNA生物農藥--″核酸干擾素″命名函。其主要為針對煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的核酸干擾素,目前已經進入田間測試階段(https://www.zhongqiwang.cn/index.php?s=/qita/7016.html)。

2.2  RNA生物農藥商品化進展

RNAi技術在農業病蟲害防治中的應用方式主要有兩種：一是通過轉基因手段在植物中表達針對病蟲害靶標基因的dsRNA,從而實現病蟲害防控,是一種以轉基因作物為主的植物源保護劑(plant incorporated protectant,PIP)；二是直接將dsRNA制成噴劑,利用噴灑的方式進行害蟲防治,即非植物源保護劑(non plant incorporated protectant,non-PIP)。

2.2.1  植物源保護劑形式的RNAi產品

針對植物源保護劑形式的產品,2017年,孟山都公司(現拜耳)新一代轉基因玉米MON87411獲得EPA批準,隨后在多個國家獲得種植許可,用于防治玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera)。該產品在玉米中同時表達了Bt蛋白(Cry3Bb1),耐除草劑基因cp4 epsps,以及針對玉米根螢葉甲Snf7的dssnf7,MON87411是國際上首例在植物中表達dsRNA的產品。2021年1月21日,拜耳宣布該產品獲得中國農業農村部頒發的轉基因生物安全證書(進口和食品/飼料用途),進一步加速了該產品的商業化進程。同時,拜耳預計該產品于2022年在美國進行商業化種植,2023年在加拿大進行推廣,未來幾年內,推廣1,500萬英畝(約600萬公頃)。2021年2月9日,澳新食品標準局(FSANZ)批準基于RNAi的耐除草劑和抗蟲玉米產品DP23211用于食品,該轉基因玉米同時表達了dsDvSSJ1和IPD072Aa蛋白用于防治玉米根蟲(Diabrotica spp.)(https://www.foodstandards.gov.au/code/applications/Pages/A1202.aspx)。

此外,還有多個基于RNAi技術的轉基因植物獲批,進行商業化種植。2014年,JRSimplot的InnateÔ(SPS-ØØE12-8(E12))馬鈴薯在美國獲準種植,隨后在馬來西亞、加拿大、墨西哥、日本、澳大利亞和新西蘭等多個國家獲批。該種馬鈴薯攜帶4個RNAi基因,其中3個針對″改善″丙烯酰胺水平,第4個針對黑斑病毒控制基因(https://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=381)。

2018年,拜耳(孟山都)轉基因大豆(MON87705)商業化(https://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=177)。該大豆能夠通過特定基因修飾改善脂肪酸譜,而且該公司已申請該作物的國際出口。

我國在植物源保護劑形式的RNAi產品研發和應用方面也取得了較好的研究結果。中國科學院微生物研究所郭惠珊團隊長期致力于應用RNAi技術進行棉花抗黃萎病的研究工作,2019年,該團隊與新疆華晨合豐投資有限公司達成戰略合作協議,該公司將在最短時間內資助課題組改善中試、生產性試驗以及品種審定等環節,加速成果轉化和產業化速度。

2.2.2  非植物源保護劑形式的RNA生物農藥

2019年,拜耳向美國EPA提交了新產品BioDirect,該產品是利用RNAi原理,通過dsRNA進行蜜蜂狄斯瓦螨防治,這是向EPA提交的第一份外源應用的RNA生物農藥活性成分。2021年5月,拜耳將該部分專利授權給Greenlight Biosciences進行dsRNA的生產,新產品預計2024年上市。另外,Greenlight Biosciences公司對外宣布,將在2022年向EPA提交注冊一種用于防控馬鈴薯甲蟲的dsRNA產品。同時,該公司也在積極研發針對白粉病以及灰霉病的RNAi產品,預計2025年能夠作為第一款殺菌劑進行批準上市。

此外,還有多家公司布局直接噴灑型的RNAi產品。RNAissance Ag LLC在積極開發針對小菜蛾的噴霧式RNA生物農藥；先正達公司在進行馬鈴薯甲蟲RNAi殺蟲劑的研制,并且預計在7～10年實現商業化。

從目前的研發狀況來看,基于RNAi技術的抗病蟲產品在未來幾年具備上市的可能性。目前,我國尚無提交注冊的RNAi農用相關產品。

03

國際上對RNA生物農藥相關政策及解讀

3.1  經濟合作與開發組織(OECD)文件解讀

目前為止,還沒有任何一個外源施用的dsRNA殺蟲劑被批準使用,然而,一旦有該類產品獲準上市,會影響到整個農藥行業的格局。因此,國際上相關領域的科學家及農藥公司也在密切關注RNA生物農藥的動向。

2019年4月10～12日,經濟合作與開發組織(Organization for Economic Cooperation and Development,OECD)在巴黎組織會議討論dsRNA作為外用植物保護劑的使用情況,該會議由來自學術界、工業界和政府的60余名成員參加,出席會議的國家包括澳大利亞、奧地利、比利時、加拿大、捷克共和國、丹麥、愛沙尼亞、法國、德國、匈牙利、荷蘭、瑞士、英國和美國,此外,代表歐盟委員會的相關專家也出席了會議。會議就RNAi相關產品的研發,外部使用dsRNA的環境歸屬問題,以及在非目標生物(non-target organism,NTO)中的暴露情況進行了討論與總結。2020年9月25日,OECD在Series on Pesticides No.104在線正式發表″關于噴灑或外部施用dsRNA殺蟲劑的環境風險評估的考慮″,就OECD會議內容進行了總結。

會議就噴灑型RNA生物農藥在農業中的應用進行討論,主要包括RNA生物農藥結構、特點、商品化類型；基于dsRNA的產品監管和政策；dsRNA在環境中的命運、對非靶標物種的影響、環境風險評估、對人類健康風險評估,并對一些目前尚不確定的因素進行了分析。主要內容可概括為如下幾點：

(1)針對噴灑型RNA生物農藥的研發和應用,制劑和配方至關重要。因為相比于傳統化學農藥,dsRNA在環境中更易于降解,合適的制劑和配方對于dsRNA的吸收和穩定性非常關鍵。此外,會議認為,現有的評價Bt轉基因作物穩定性的標準可以作為dsRNA相關產品在進行環境歸宿以及穩定性評估的參考。

(2)RNA產品的環境命運和對非靶標物種的影響至關重要。會議討論了生物信息學在進行潛在風險評估中的應用,由于不同物種對于dsRNA的攝取方式不同,RNAi機制不同,因此利用生物信息學在進行脫靶效應的風險評估方面的價值是有限的,單獨對于序列的生物信息學分析不能作為對非靶標物種影響的唯一預測指標,但是其在dsRNA產品的設計階段以及對于非靶標物種進行研究時至關重要。

(3)RNA產品對人類健康及潛在影響問題。OECD會議認為,dsRNA作為核酸類物質,與人類及其他可能攝取的生物體中的基因序列組成相同。核酸是植物、動物性食品和飼料的天然成分,是人類和動物日常消耗品。同時,人類和其他脊椎動物中存在顯著的生理和生化屏障,比如唾液及消化道中的核酸酶、胃液中的pH差異、細胞中的溶酶體等都影響外源dsRNA核酸的攝取。因此,dsRNA對于人類健康來說,是相對安全的。

(4)一些目前尚不確定的問題,也可能是影響RNA生物農藥的重要因素。比如一些生物中含有RNAi的信號放大效應,這會影響到dsRNA環境暴露的評估；不同生物體中不同的RNAi通路相關機制,可能產生相應的脫靶效應；同時,如果隨著dsRNA的大量使用,隨之而來可能產生對RNA生物農藥的抗性問題,也是需要考慮的。

此外,根據RNAi機制和作用原理,相比于傳統的化學農藥,以dsRNA為基礎物質的生物農藥可能需要更長時間的見效期,這也是在進行環境及毒理評估時應該考慮的問題。

OECD會議的召開,以及相關工作文件的發表,說明RNA生物農藥已經逐漸被政府了解、重視,并對相關問題進行考慮。這也將進一步促進RNA生物農藥研發、上市、推廣、應用等各個環節。

3.2  歐美一些國家對于RNA生物農藥的歸類

基于RNAi技術的RNA生物農藥具有眾多的優勢,相比于傳統的化學殺蟲劑,其具有更強的特異性,且容易在環境中降解,因此,是一種綠色無污染的生物農藥。另外其研發較易,開發費用低,技術層面的問題較易解決,但在其商業化應用之前,仍需要經過不同國家相關部門的安全評估和授權程序。

3.2.1  美國對RNA生物農藥的歸類及安全性評價

針對植物中表達dsRNA的植物源保護劑,美國環境保護署(U.S. EPA)已經批準拜耳的轉基因玉米MON87411,該轉基因玉米同時表達Cry3Bb1、CP4EPSPS及dsDvSnf7。EPA針對MON87411中產生的成分dsDvSnf7作為生物化學物質進行了環境持久性研究,評估了其在陸地及水環境中的歸宿,同時評估了針對非靶標生物鳥類、哺乳動物、淡水無脊椎動物、淡水魚、海洋和河口魚類及無脊椎動物,非靶標昆蟲、蜜蜂及其他無脊椎動物的毒性及安全性。筆者注意到,在進行環境風險評估時,某些物種只用到了生物信息學分析的方法,并以分析結果作為環境評估的依據。比如,對鳥類的紅隼、石鴿和綠頭鴨,哺乳動物中的肉牛、家養狗、馬、家鼠、挪威大鼠、豬,蜜蜂和大黃蜂基因組進行了生物信息學分析。dsDvSnf7對非靶標物種的影響主要是對廣泛類群以及最有可能受到影響的物種的測試,主要評估了包括物種生存、生長、發育和繁殖在內的各項影響,并選擇足夠長的時間評估潛在的不良反應。同時,考慮到實驗中dsRNA可能降解的問題,采取了足夠高的濃度進行測定。EPA的結論顯示,dsDvSnf7不太可能對非靶標物種具有生物學意義上的影響(https://www.epa.gov/sap/meeting-materialsjanuary-28-2014-scientific-advisory-panel,https://www.epa.gov/sap/meeting-materials-september-27-28-2016-scientific-advisory-panel)。值得注意的是,EPA對該產品進行風險評估過程中,大量的測試并不是通過轉基因植物或者植物提取物,而是通過合成游離的dsDvSnf7進行的,這也為未來基于直接利用dsRNA生物農藥的環境評估提供了一個參考。

針對直接使用的非植物源RNA生物農藥,目前尚未有產品獲得EPA批準。在美國,針對各類型的此種產品,主要由《聯邦殺蟲劑、殺菌劑和滅鼠劑法》(FIFRA)和《聯邦食品、藥品和化妝品法》(FFDCA)進行農藥的規范和管理,并授權EPA對農藥進行登記與評估。所有的殺蟲產品需要經過EPA注冊、登記,才能進行后續的生產、運輸和銷售。田間測試也需要經過實驗使用許可,EPA評估農藥最終使用產品的注冊,并對活性成分和實際產品進行評估。美國多數州參考EPA的審查數據和結論,但是也有少數幾個州需要向其提交數據,進行隨后的評估。

針對噴灑型的dsRNA產品,由于目前尚未有產品被批準上市,因此,并沒有關于噴灑型dsRNA類農藥的明確歸類問題。但是,基于上述美國對植物源RNA生物農藥的檢測和管理可以看出,美國EPA更傾向于將其作為生化殺蟲劑進行相關的要求,關于這一點,可以參照EPA頒布的″聯邦法規第40篇(CFR)第158部分″,以及″Subpart U-Biochemical Pesticides of 40 CFR Part 158″的數據要求,對農藥活性成分和產品進行評估。

3.2.2  歐盟及其他國家對RNA生物農藥的歸類及相關政策

在歐盟,任何植物保護產品(plant protection products,PPP)(農藥),均需要對其活性物質和最終產品進行授權,其中活性物質的授權是植物保護產品(農藥)授權的先決條件。歐盟委員會(European Commission)依托歐洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)對活性物質進行風險評估與指導。此外,OECD、歐洲和地中海地區植物保護組織(European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO)和EFSA編制的指導文件對這些法規進行了補充,描述了活性物質和農藥產品風險評估的方法學要求。

在歐盟,主要將PPP分為化學品、微生物以及基礎物質,并沒有美國以及中國農藥分類體系中生物農藥這個類別,由于dsRNA的PPP并不屬于微生物以及基礎物質范疇,目前還沒有任何具體的指導文件定義基于dsRNA的PPP授權,但是OECD(2020)給出了一定的指導意見。目前基于dsRNA的PPP在歐盟仍被視為化學PPP,但也有可能會根據具體情況決定對特定關注領域的風險評估進行豁免或者調整。

盡管目前還沒有針對dsRNA產品的法規政策,但在歐盟,以dsRNA作為活性物質的PPP應用預計在未來幾年內實現。因此,歐盟主管當局應開始深入討論未來如何充分評估此類產品的風險。目前,EFSA將RNA生物農藥風險評估定義為安全,因為噴灑的dsRNA對動物、人類造成的風險很低。具有決定性的論點認為,由于噴灑dsRNA需要克服較多的生物和物理屏障,因此,口服RNAi產品對于干擾人類基因表達的概率很低,造成風險的可能也很小。

2018年5月,新西蘭環境保護局決策委員會(the Decision-Making Committee of the New Zeal and Environmental Protection Authority)發布了一份公告,結論是用dsRNA處理(包括攝取、吸入和吸收)的真核細胞或者生物體不屬于新的生物。因為通過dsRNA處理真核生物,并不能修飾及改變其染色體DNA,也不能產生可遺傳的變異,不屬于新的生物體,因此,無需進行風險評估。同時,新西蘭初級產業部(the Ministry of Primary Industries)將RNA列入″可忽略不計的風險登記冊″。因此,在新西蘭,任何人都可以在開放環境中使用任何dsRNA材料處理真核生物(尚未被列為生物安全威脅),而無需任何事先批準。

04

RNA生物農藥亟需解決的問題

4.1  RNA生物農藥技術層面需要解決的問題

依據目前的研發進度,RNA生物農藥極有可能在未來幾年上市。目前來看,RNA生物農藥在技術層面上還有一些問題需要解決。

4.1.1  高效RNAi靶標基因的篩選

RNA生物農藥優勢之一是利用低劑量dsRNA即能夠引起高效RNAi效應,因此,獲得目標生物高效致死的RNAi靶標基因是研制RNA生物農藥的關鍵。目前對于靶標基因的篩選和獲得,可以通過以下幾種方式：(1)已知的病蟲生長發育過程中的關鍵基因,作為可能的靶標基因進行篩選；(2)通過相近物種中已知的高效靶標基因的同源序列基因進行篩選；(3)通過測序技術,對病蟲不同組織、不同發育階段基因進行研究和篩選,從而獲得高效致死作用的靶標基因。通過這些方式,已經獲得多個重要害蟲的靶標基因。但是,在篩選靶標基因的同時,也發現不同種類昆蟲RNAi效率不同。比如,相比于鞘翅目、直翅目昆蟲,鱗翅目昆蟲RNAi效率較低,高效致死作用的靶標基因篩選也相對困難。這可能是由于昆蟲自身特異基因、中腸環境、RNAi通路機制存在差異所導致。在針對此類昆蟲篩選靶標基因時,就需要綜合考慮。由于同一靶標基因在不同物種中行使的功能并不完全一致、不同作用機制的靶標基因抗性程度可能存在差異、不同物種中RNAi作用機制存在差異,而這些都是影響靶標基因作用效果的重要因素,因此,在選擇靶標基因的過程中均需考慮。

4.1.2  dsRNA的生產成本

dsRNA合成成本是RNA生物農藥能否在田間施用的至關重要的因素。合成dsRNA主要包括化學合成、體外合成以及微生物發酵合成3種方式。化學合成成本高,并且隨著dsRNA合成長度的增加,合成錯誤率增加,一般僅適用于實驗室研究的小劑量使用,而不適合大規模生產；體外無細胞系統的合成方式主要通過表達dsRNA的元件,之后通過對合成體系進行調整優化,進行體外合成并純化。目前,基于此種合成方法,美國Greenlight Biosciences公司研發了無細胞合成體系,能夠將dsRNA的合成成本控制在1美元/g以內,其成本已經能夠滿足田間規模化應用的要求；利用微生物發酵表達合成dsRNA也是目前可能規模化應用的方式之一,已在包括大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等多種底盤細胞中構建并得到合成dsRNA的菌株,通過提取微生物發酵產物或者將微生物滅活后處理相關的靶標生物,均能夠產生相應的RNAi表型。例如加拿大Renaissance BioScience公司通過專屬的酵母載體表達dsRNA,飼喂馬鈴薯甲蟲,能夠精準地抑制靶標基因的表達,并且對馬鈴薯甲蟲致死率高達98.3%,達到保護植株的功效。

4.1.3  dsRNA的穩定性

dsRNA屬于核酸類物質,在復雜的大田環境(pH、光照、雨水、微生物等)中或者存在核酸酶的情況下,極其容易發生降解。因此,RNA生物農藥的穩定性及貨架期對于此類產品的開發至關重要。目前,已經有多種手段提高dsRNA的穩定性。例如,通過納米包被,顯著提高dsRNA的穩定性；通過BioClay的包被,能夠顯著提高dsRNA在葉片上的存在時長,增加噴灑型dsRNA的作用效率。同時,也有多家公司專門開展針對dsRNA穩定性的各種助劑以及納米顆粒的研發,結果顯示,添加各種輔助產品可顯著增加dsRNA在環境及靶標生物體內的穩定性。

4.1.4  其他問題

除上述幾個主要問題外,RNA生物農藥的遞送效率、RNA生物農藥在進行環境風險評估時殘留量的檢測等均為該類農藥應用之前亟需解決的關鍵問題。隨著科研機構、相關企業以及投資機構對該領域的進一步深耕,相信這些問題能夠迎刃而解,從而推動RNA生物農藥的早日推廣使用。

4.2  RNA生物農藥的環境評估及政策層面需要解決的問題

RNA生物農藥能否早日實現商業化應用,除了技術層面的問題之外,還面臨著可能的環境及政策層面需要解決的問題。

RNA生物農藥在獲得農藥許可證書之前,需要進行環境風險評估。主要包括評估應用過程中釋放的dsRNA在環境中的存在及降解情況,對非靶標物種的影響,以及對人類健康存在的可能風險。對于dsRNA含量,目前在實驗室條件下主要采用分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳及PCR進行檢測,需要相對專業的實驗室環境。由于不同檢測方法的靈敏度存在差異,因此需要研發針對環境中痕量dsRNA的簡便、快速、高靈敏度檢測方法。目前,通過放射性同位素32P標記的方法,可以顯著提高環境中dsRNA的檢測靈敏度。在對非靶標物種的影響方面,除了采用傳統的急性及慢性毒理檢測手段之外,根據RNAi的作用機制(dsRNA僅對能夠良好匹配的目標mRNA產生抑制作用),能否利用生物信息學手段對非靶標物種的整個基因組序列進行分析,預測目標dsRNA對于非靶標物種的可能影響？這種檢測方法的可信度以及能否作為一種技術手段或參考應用于RNA生物農藥的環境毒理檢測,也是需要深入探討的重要問題。

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總結與展望

RNA生物農藥具有眾多優勢：(1)利用RNAi技術可以針對某種病害或蟲害設計物種專一性RNA生物農藥,同時不影響非靶標生物；(2)可以利用物種間的共有靶標設計出針對多個物種的種間廣譜性RNA生物農藥；(3)以dsRNA為主體形式的制劑在環境中能夠快速降解,在保證防治效率的前提下,殘留和環境污染問題幾乎可以忽略；(4)該技術只是暫時關閉害蟲某個基因的表達,沒有改變生物體自身的基因組,不會產生可遺傳的變異,因此幾乎不影響生態系統；(5)靶標基因的可替代性較高,不容易產生抗藥性；(6)RNA生物農藥產品制劑具有純度高、起效快、無毒、無污染、防控范圍廣、價格低廉等化學農藥和常規微生物農藥所無法比擬的優點,在市場競爭中擁有比較明顯的優勢。

當前RNA生物農藥在全世界范圍內發展迅猛,已有兩例基于轉基因的產品(MON87411和DP23211)批準上市,基于直接噴灑型的RNA生物農藥,盡管沒有相應的產品,但是,國際上多家農化巨頭公司均有相關產品的大規模布局,預期近幾年會有相關的產品上市,而我國在此領域尚處于起步階段。RNA生物農藥作為農藥史上革命性產品,將是我國在農藥領域實現彎道超車的一次重要機遇。同時,RNA生物農藥如何使用,環境釋放風險評估等均是至關重要的問題,需要進行充分的調研和商討。并且,針對直接噴灑型的RNA生物農藥,目前可以通過微生物發酵獲得,也可以通過體外直接合成dsRNA產品,那么,對于兩種來源的dsRNA,能否歸于同一個類型,需要管理機構充分考慮并進行規范管理。目前,影響我國RNA生物農藥產業化的瓶頸有兩個：一是dsRNA的低成本規模化生產；二是相關政策的制訂及應用許可。因此,加速推進我國在RNA生物農藥領域的深度布局,快速形成一批具有核心知識產權的新興農藥公司,有助于樹立我國在該領域的國際地位。目前,我國已經將RNA生物農藥作為優先發展領域,這說明,政府部門也已經注意到RNA農藥的發展前景,并對此進行了相應的規劃,這無疑對于RNA生物農藥的發展是利好消息。當然,快速推動RNA生物農藥的發展與問世,還需要政府部門充分考慮我國的現狀,并積極制定相關的政策法規,同時,也需要國內傳統的農藥生產企業具有前瞻性視野,進行長期布局,并吸引民間資本進行規模化的研發和產業結構調整,以快速推動RNA生物農藥的應用和商品化。