該研究研發出一種利用宿主昆蟲體內具有免疫抑制功能的miRNAs,遺傳改造殺蟲真菌增強其生防效力的″以子之矛,攻子之盾″新方法,為生防菌的遺傳改良開辟了新方向。

昆蟲通過取食作物或吸血給農業生產和人類健康造成嚴重危害。蚊蟲是瘧疾、登革熱、黃熱病、寨卡等多種疾病的傳播媒介,對人類的健康和生命安全造成了嚴重威脅。目前,蚊蟲的防治主要依賴化學殺蟲劑,但是化學農藥的長期使用導致蚊蟲對殺蟲劑產生抗藥性,迫切需要研發新的綠色替代工具來安全有效地防治蚊蟲。球孢白僵菌作為一種天然的昆蟲病原真菌,能夠通過體表侵染并殺死昆蟲,對防治刺吸式口器的蚊蟲具有獨特的優勢,是一種環境友好型的微生物殺蟲劑。

然而,由于病原真菌一般殺蟲時間長(一般需要一周甚至更長的時間),制約了真菌殺蟲劑的廣泛應用。這主要是由于昆蟲在與病原菌長期攻防和博弈的過程中進化出高效的免疫防御系統對抗真菌的侵染所致。為此,許多研究通過高表達外源毒素或毒力蛋白等對菌株進行遺傳改良來增強生防真菌殺蟲效力。但是效應蛋白作用靶標單一,還會導致靶標昆蟲產生選擇性壓力,因此亟待開發多靶點、無選擇壓力、更加安全的效應因子對殺蟲真菌進行遺傳改良。

圖：蚊子吸蜜

Small RNA(sRNA, 主要包括miRNA和siRNA)介導的RNA干擾(RNA interference, RNAi)是真核生物中高度保守的基因轉錄后表達干擾機制。miRNA在昆蟲響應病原菌侵染的免疫調控中發揮重要作用。王四寶團隊前期研究發現,sRNA可在蚊蟲與病原真菌間進行雙向傳遞,參與調控蚊蟲免疫和病原真菌的致病性,這種突破物種界限,跨物種轉運到寄主或微生體細胞內干擾靶基因表達的現象,稱為跨界RNA干擾(Cross-kingdom RNAi)。這種sRNA的雙向跨界傳遞表現在：蚊蟲可以將自身保守的miRNA傳遞到病原真菌細胞來跨界抑制致病基因的表達,抑制真菌感染^【1】；同樣,病原真菌也可以將自身上調表達的sRNA跨界轉運到感染蚊蟲細胞內干擾免疫基因的表達^【2】。這些前期研究提示我們或許可以利用sRNA在昆蟲與病原菌互作過程中跨界調控的功能,使其成為高效的效應因子應用于生防真菌的遺傳改造。

本研究中,研究人員從埃及伊蚊體內篩選鑒定出兩個負調控其自身Toll免疫信號通路的miRNAs (miR-8和miR-375),通過基因工程改造,在白僵菌中成功構建表達伊蚊miR-8或miR-375的工程菌株。與野生型白僵菌相比,表達伊蚊miRNAs的轉基因菌株在感染蚊蟲過程中能夠產生大量miR-8或miR-375,這些miRNAs能夠從真菌細胞跨界轉運到感染的蚊蟲細胞內,分別靶向沉默伊蚊Toll免疫信號通路受體Toll5B和轉錄因子Rel1A的轉錄表達,同時還激活Toll通路抑制因子Cactus的轉錄表達,從而下調蚊蟲抗菌肽基因表達,降低蚊蟲抗真菌的免疫反應,進而增強白僵菌對蚊蟲的致病力和加快蚊蟲死亡速度。

野外調查研究發現,多地蚊蟲對氯菊酯、氯氰菊酯等各類化學殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性,嚴重影響蚊蟲防治效果。為驗證蚊蟲免疫抑制性miRNAs改造的白僵菌是否對抗性蚊蟲有防治效果,研究人員對具有多種殺蟲劑抗藥性的埃及伊蚊Jinghong品系進行測試,發現表達miR-8或miR-375的工程菌株比野生型菌株表現更強的殺蟲效果,縮短半數致死時間(LT50)達30%左右。

研究人員進一步分析發現miR-8和miR-375在埃及伊蚊、岡比亞按蚊、小菜蛾等多種害蟲中序列保守,靶基因預測分析發現miR-8和miR-375都能靶向這些昆蟲的Toll免疫信號通路相關基因。為驗證表達 miR-8或miR-375的工程菌株是否對其它害蟲也有防治效果,研究人員對鱗翅目害蟲大蠟螟進行測試,發現表達miR-8和miR-375的菌株對大蠟螟呈現較強的致病力,顯著加速白僵菌對大蠟螟的擊倒時間,能夠縮短半數致死時間(LT50)達20%-40%左右,共表達miR-8和miR-375對菌株毒力有顯著增效作用。

圖：利用病原菌介導的RNAi (pathogen-mediated RNAi,pmRNAi)提高生防真菌殺蟲效力

該研究中王四寶研究員團隊利用″以子之矛,攻子之盾″的策略,首次開發出一種利用生防菌表達寄主miRNAs跨界干擾害蟲基因的表達來提高生防菌殺蟲效力的新方法(pathogen-mediated RNAi,pmRNAi)。pmRNAi方法具有以下多重優點：

1)使用寄主來源的miRNA進行菌株改良可避免害蟲產生抗性選擇壓力,因為昆蟲對自身免疫和生理健康至關重要的內源性miRNA不易產生選擇抗性；

2)相對于外源毒素或毒蛋白基因,使用害蟲自身的miRNA可以消除公眾對工程菌株生物安全性的擔憂；

3)某些昆蟲來源的miRNAs具有種屬特異性,因此可通過定制害蟲特異的miRNA來改良菌株,提高工程菌的寄主靶向性和特異性；

4)相對于靶標單一的殺蟲毒蛋白,miRNA具有多靶標特性,單個miRNA可在一個或多個途徑中靶向多個基因以發揮其生物學功能,而且一個靶基因的表達也可受到多個miRNAs的組合調控；

5)在理論上一個菌株中可表達多個寄主miRNAs,從而實現對害蟲免疫或其他生理過程的重要靶基因或通路的操控,有效提高真菌殺蟲劑的防治效果,使得該方法在生防菌的遺傳改良上具有巨大的應用潛力。

該研究利用豐富的寄主miRNAs改造生防菌,為開發安全和高效的真菌等生物殺蟲劑開辟了新方向和新思路,為昆蟲與病原體相互作用研究提供新的思路。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111527

參考文獻

【1】Cui C, Wang Y, Liu J, Zhao J, Sun P, Wang S. A fungal pathogen deploys a small silencing RNA that attenuates mosquito immunity and facilitates infection. Nat Commun. 2019,20;10(1):4298. doi: 10.1038/s41467-019-12323-1.

【2】Wang Y, Cui C, Wang G, Li Y, Wang S. Insects defend against fungal infection by employing microRNAs to silence virulence-related genes. Proc Natl Acad Sci USA. 2021,11;118(19):e2023802118. doi: 10.1073/pnas.2023802118.