日益嚴重的草甘膦耐藥性

草甘膦自20世紀70年代問世以來,風靡全球,逐漸成為最廉價、應用最廣、產量最大的廣譜除草劑。它通過特異性來抑制植物生長代謝過程中關鍵的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶,從而引起包括雜草在內的植物代謝紊亂和死亡。“因此,培育抗草甘膦的轉基因作物并搭配草甘膦在田間使用,是現代農業中控制雜草的一種重要方式?！惫鹜ソ榻B。

然而,隨著草甘膦的廣為使用及濫用,數十種雜草逐漸進化,產生了較高的草甘膦耐受性。此外,抗草甘膦的轉基因作物并不能夠分解草甘膦,導致草甘膦會在作物內積累和轉運,還有可能通過食物鏈傳播危害人類健康。

因此,亟須挖掘可以降解草甘膦的基因,以培育低草甘膦殘留的高抗草甘膦轉基因作物。

2019年,中國和澳大利亞的研究團隊首次從抗草甘膦的芒稗中,鑒定出2個降解草甘膦的醛酮還原酶--AKR4C16和AKR4C17,AKR4C16和AKR4C17利用NADP+(煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸,一種輔酶)作為輔因子,將草甘膦降解為無毒的氨甲基膦酸和乙醛酸。

“AKR4C16和AKR4C17是首次報道的植物自然進化產生的草甘膦降解酶。”本文共同通訊作者戴隆海副教授說,但對于這兩個蛋白是怎么催化草甘膦降解的分子機制一直尚不清楚,阻礙了進一步開發利用這兩種降解酶解決耐藥性和草甘膦難以降解的難題。

酶結構設計改造提升草甘膦降解效率

為了深入探究AKR4C16和AKR4C17降解草甘膦的分子機制,郭瑞庭教授團隊通過X射線晶體衍射技術分別解析了這兩種酶與輔因子高分辨率的復合體結構,揭示了草甘膦、NADP+與AKR4C17合成三元復合體的結合模式,提出了AKR4C16和AKR4C17介導草甘膦降解的催化反應機制。

NADP+和草甘膦分別與AKR4C17活性區關鍵氨基酸殘基通過氫鍵、疏水作用等分子間作用力,結合在AKR4C17的底物結合區。然后,NADP+的煙酰胺基團的C4位點奪取草甘膦C2位的一個氫原子；C2位失去1個氫原子的草甘膦分子不穩定,在活性區的催化氨基酸位點經由草甘膦的磷酸基團輔助下,草甘膦分子內的C-N鍵氧化斷鏈,降解為無毒的氨甲基膦酸和乙醛酸,這一過程中NADP+同時被還原生成NADPH。

在獲得了AKR4C17/NADP+/草甘膦的精細三維結構模型后,郭瑞庭教授團隊進一步對草甘膦與AKR4C17的底物結合區進行分析,發現草甘膦分子的磷酸基團與AKR4C17底物口袋缺少有效的分子間相互作用力,使得草甘膦與AKR4C17底物口袋的結合不夠牢固,可能不利于AKR4C17催化草甘膦的降解反應。

通過對AKR4C17的結構分析,團隊發現AKR4C17底物口袋區的苯丙氨酸F291位點與草甘膦的磷酸基團距離較近,將F291位點突變成組氨酸(F291H)、賴氨酸(F291K)、精氨酸(F291R)或天冬氨酸(F291D)后,研究團隊發現這些突變體的活性均有不同程度的提升；其中,F291D突變體對草甘膦的催化活性較野生型AKR4C17提高了70%。進一步解析AKR4C17F291D的晶體結構發現,F291D位點的突變增強了AKR4C17底物結合口袋與草甘膦分子間的親水作用,從而使草甘膦分子更穩定地結合在AKR4C17的底物結合口袋,增強了AKR4C17介導的草甘膦降解反應。

“我們的工作揭示了AKR4C16和AKR4C17催化草甘膦降解的分子機制,為進一步改造AKR4C16和AKR4C17,以提高其對草甘膦的降解效率奠定了重要的基礎；另外,我們成功構建了草甘膦降解效率提升的突變體蛋白AKR4C17F291D,為培育低草甘膦殘留的高抗草甘膦轉基因作物,以及利用微生物工程菌降解環境中的草甘膦,提供了重要的參考。”戴隆海表示。